Токаревич Николай Константинович – заведующий лабораторией
д.м.н., профессор, врач высшей категории
тел.: (812) 644-63-81, каб. 243, email: tokarevich@pasteurorg.ru
Антонов Семён Анатольевич – младший научный сотрудник
тел.: (812) 644-63-81, email: antonov@pasteurorg.ru
Баимова Регина Равилевна – младший научный сотрудник
тел.: (812) 644-63-81, email: baimova@pasteurorg.ru
Блинова Ольга Владимировна – младший научный сотрудник
тел.: (812) 644-63-81, email: blinova@pasteurorg.ru
Лаборатория зооантропонозных инфекций начала свою деятельность в 1933 г. в качестве структурной единицы на базе отдела паразитарных тифов (основатель отдела Н.Н. Романенко).
В течение 25 лет руководство лабораторией осуществлял К.Н. Токаревич (в последующие годы заведующими были Ф.И. Красник, Е.М. Попова, Б.В. Вершинский, А.Б. Дайтер). С 1993 г. лабораторией руководит Н.К. Токаревич.
На протяжении многих лет одной из основных тем исследований, проводимых в лаборатории, были риккетсиозы: сначала сыпной тиф, включая его редуцированную форму (болезнь Брилля), затем – крысиный риккетсиоз, коксиеллез и клещевой риккетсиоз Азии. В настоящее время – моноцитарный эрлихиоз человека и гранулоцитарный анаплазмоз человека.
В результате многолетних исследований по проблеме сыпного тифа выявлены патогенетические, эпидемические, клинические и иммунологические особенности повторного сыпного тифа и впервые в нашей стране сформулирована концепция о рецидивном происхождении повторных заболеваний сыпным тифом.
Сотрудники лаборатории одними из первых в стране начали исследования по изучения «новой» для того времени болезни – Ку-лихорадке (К.Н. Токаревич, Л.Д. Васильева, Н.И. Амосенкова, А.Б. Дайтер). В 50-е годы были расшифрованы вспышки Ку-лихорадки у сельских и городских жителей на северо-западе России, установлены природные и хозяйственные очаги этой инфекции, усовершенствованы серологические методы диагностики коксиеллеза.
В связи с ростом в Ленинграде в 30-е годы заболеваний неясной этиологии сотрудники лаборатории провели исследования, которые опровергли господствующее в то время представление о тифо-паратифозной природе описываемых недугов. Были выделены лептоспиры серогруппы Icterohaemorrhagiae от крыс, а затем и больных людей, доказано наличие болезни Вейля-Васильева и резервуара этой болезни в городе. В условиях войны инфекция приобрела массовый характер. В трагических условиях блокады Ленинграда, под бомбежками и артиллерийскими обстрелами, несмотря на тяжелейшую дистрофию, сотрудники лаборатории К.Н. Токаревич, Е.М. Попова и Н.И. Амосенкова установили лептоспирозную этиологию этой эпидемии, источники и пути распространения инфекции, описали особенности ее клинических проявлений.
Результаты исследований нашли свое отражение в первых отечественных монографиях на эту тему: «Инфекционная лептоспирозная желтуха (болезнь Вейля)» (М.К. Даль, К.Н. Токаревич, М.Д. Тушинский, Е.А. Волкова, М.Н. Фигурина, 1944) и «Лептоспирозная желтуха в Ленинграде во время Великой Отечественной войны и блокады» (К.Н. Токаревич, 1947).
Наряду с риккетсиозами и лептоспирозом в разные годы получили развитие и другие направления, посвященные изучению эпидемиологии, лабораторной диагностике и профилактике орнитоза, туляремии, иерсиниоза, геморрагической лихорадки с почечным синдромом, клещевого энцефалита и других арбовирусных инфекций (К.Н. Токаревич, А.Б. Дайтер, Б.В. Вершинский, Л.А. Вишнякова, Г.Я. Ценева, Ф.С. Носков, Е.Д. Соколова, И.И. Камалов и др.). Таким образом, общая линия в эволюции профиля научных исследований и прикладных разработок характеризовалась расширением перечня нозологических форм с акцентом на инфекции, общие для животных и человека (зооантропонозы).
Одним из основных направлений научной деятельности лаборатории на протяжении многих лет является региональная эпидемиология зооантропонозных инфекций на северо-западе России. За разработку концепции ландшафтной нозогеографии и системного картографирования сотруднику лаборатории Б.В. Вершинскому была присуждена Государственная премия СССР.
К настоящему времени выявлены множественные природные очаги этих инфекций в Северо-Западном федеральном округе (СЗФО), показана их трансформация под влиянием урбанизации. Сформулированы положения об эволюции лептоспирозов, установлены причины значительного роста заболеваемости и высокой летальности при этой инфекции в Санкт-Петербурге в 80-90-е гг. XX и в начале XXI вв. Показано, что этиологическая структура лептоспироза, социально-профессиональный состав больных и клиническое течение инфекции существенно меняется в пространстве и времени (Н.А. Стоянова, Г.Ф. Трифонова, С.О. Майорова, Н.К. Токаревич).
Совместно с врачами санэпидслужбы проанализированы многолетние данные о заболеваемости «клещевыми» инфекциями в СЗФО. Показано, что современная эпидемическая ситуация в регионе в целом характеризуется ростом заболеваемости, изменением ее структуры, снижением доли в общем числе заболевших контингентов с профессиональным риском инфицирования, увеличением количества пострадавших от клещей, экспансий I.persulcatus на север, выявлением сочетанных очагов инфекций и распознанением «новых» моно- или смешанных инфекций, вызванных одним-двумя или более возбудителями. Определены реальные предпосылки для расширения очагов коксиеллеза и «клещевых» инфекций и интенсивность их эпидемического проявления. Показана (совместно с А.А. Трониным) эффективность комплексного использования наземных и спутниковых методов слежения за состоянием окружающей среды, включая метеорологические факторы для оценки их влияния на активность очагов «клещевых» инфекций. Получены новые знания о распространении иксодовых клещевых боррелиозов (болезни Лайма) в Северо-Западном федеральном округе и о геновидовом составе B.burgdorferi sensu lato, циркулирующих на этих территориях. Определен генотип вируса клещевого энцефалита, выявленного в клещах Ixodes persulcatus, собранных в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (И.В. Шулайкина и др.). Впервые в ряде областей этого региона в клещах Ixodes persulcatus были (совместно с М. Е. Еремеевой и др.) выявлены бактерии, относящиеся к семейству Anaplasmataceae: Ehrlichia muris, Anaplasma phagocytophila, а также других представителей альфа-протеобактерий – Candidatus Rickettsia tarasevichae и эндосимбионт Montezuma.
Диагностированы «новые» для России инфекции: моноцитарный эрлихиоз человека и гранулоцитарный анаплазмоз человека. Этиологическая природа этих заболеваний среди больных с лихорадкой неясной этиологии подтверждена серологическими методами. В ходе мониторинга за зооантропонозными инфекциями были выделены, изучены и депонированы в национальные музеи оригинальные штаммы лептоспир и коксиелл, а также депонированы в базе данных Gene Bank уникальные генотипы этих патогенов.
Совместными усилиями сотрудников лаборатории и специалистов территориальных управлений Роспотребнадзора и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» получен, проанализирован, опубликован в научной литературе (в том числе, в международных изданиях) и обобщен в виде научно-методических материалов обширный массив фактических данных по широкому кругу нозологических форм.
Второе направление исследований, проводимых лабораторией, – усовершенствование и разработка средств индикации возбудителей зооантропонозных инфекций и выявления антител к ним. Так были разработаны эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностический препарат для обнаружения коксиелл Бернета в реакции непрямой гемагглютинацин (РНГА); иммуноферментная тест-система для выявления коксиелл, корпускулярный антиген коксиелл 1-й фазы для реакции связывания комплемента; эритроцитарный диагностикум для выявления антител к коксиеллам 1-й фазы в РНГА; эритроцитарный диагностикум для выявления антител к коксиеллам 1-й фазы в реакции непрямого гемолиза, иммуноферментная тест-система для определения антител к коксиеллам 1-й и 2-й фаз. На производство ряда перечисленных препаратов разработаны и утверждены технические документации. Они рекомендованы для применения в практике здравоохранения (Н.К. Токаревич, А.Б. Дайтер и др.).
Разработана технология производства иммуноферментных тест-систем для обнаружения лептоспир и антител к ним (Н.А. Стоянова и др.).
В лаборатории проводятся исследования по усовершенствованию молекулярно-генетических методов для выявления C. burnetii и лептоспир, а также для изучения генетической гетерогенности этих возбудителей. Так, было показано, что сконструированный набор праймеров, позволяющий амплифицировать фрагмент гена groEL С.burnetii, эффективен для выявления методом ПЦР возбудителей Ку-лихорадки в биологическом материале. Проведены исследования генетической гетерогенности штаммов С.burnetii, выделенных на территории России и сопредельных государств с использованием различных генотипических маркеров.
При исследовании музейных штаммов из коллекции НИИ им. Пастера методами мультиспейсер-типирования (анализ нуклеотидной последовательности межгенных спейсеров) и MLVA (мультилокусного анализа тандемных повторов переменной копийности, или VNTR) было установлено, что популяции С.burnetii, циркулирующей на территории России, свойственна относительная генетическая однородность. Однако ряд штаммов С.burnetii, штаммы Ленинград-2 и Ленинград-4, обладают, согласно анализу сиквенс-типов межгенных спейсеров, уникальным для российской популяции генотипом (О.А. Фрейлихман).
При анализе локусов VNTR также были выявлены значительные генетические отличия штамма Ленинград-2 от других штаммов, выделенных на территории России. По результатам мультиспейсертипирования и VNTR-анализа штаммы С.burnetii, выделенные в различных регионах России, филогенетически наиболее близки к группе штаммов европейского происхождения. Результаты мультиспейсер-типирования коррелируют с результатами анализа методом MLVA (Ю. А. Панферова), позволяя дифференцировать штаммы С.burnetii различного географического происхождения.
Высокая дискриминативная способность данных методов позволяет использовать их в качестве методов генотипирования и молекулярно-эпидемиологического мониторинга.
С целью разработки и усовершенствования методики типирования патогенных лептоспир для определения серогрупповой и видовой принадлежности штамма, а также для характеристики их генетических особенностей, было проведено исследование штаммов лептоспир коллекции лаборатории методом VNTR, в ходе которого были разработаны (совместно с Парижским Институтом Пастера) праймеры к кодирующим последовательностям, фланкирующие VNTR, длина которых у лептоспир разных видов варьирует.
Для типирования штаммов в зависимости от их серогрупповой и видовой принадлежности был применен метод анализа длин рестрикционных фрагментов. В ходе исследования были выявлены различные рестрикционные профили гена ompL1 лептоспир, относящихся к разным видам и разным серогруппам. Показано, что детерминирующие сайты рестрикции могут рассматриваться в качестве генетического маркера для дифференциации патогенных лептоспир.
В развитие этих исследований была оценена гетерогенность рестрикционных профилей генов факторов патогенности lsa 21, lenA и lipL32 среди лептоспир различной систематической принадлежности (согласно генетической и серологической классификации). Установлено, что ген lipL32 может быть использован для создания системы для дифференциации геномовидов патогенных лептоспир на основании полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, полученных с использованием рестриктаз Bsa29I и BamHI (А.Н. Ваганова).
Проводимые в лаборатории молекулярно-генетические исследования имеют большое значение для повышения эффективности лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора за зооантропонозными инфекциями.
Третье направление исследований лаборатории – изучение взаимоотношений возбудителей зооантропонозов с хозяевами и переносчиками.
Многолетние исследования по взаимоотношению коксиелл Бернета с клещами были обобщены в монографии «Кровососущие членистоногие и риккетсии» (Ю.С. Балашов, А.Б. Дайтер, 1973).
Изучение патогенеза лептоспироза позволило выявить различные варианты инфекционного процесса и установить ведущие патогенные свойства лептоспир: адгезия к гепатоцитам и способность к колонизации их поверхности, токсическое действие, выражающееся в нарушении микроциркуляции проницаемости сосудов, адгезия к нефротелию и колонизация его поверхности (Ю.Е. Полоцкий, В.Н. Семенович, Н.А. Стоянова).
Совместно с И.С. Фрейдлин установлено, что мишенями стимулирующего действия коксиелл Бернета являются клетки системы мононуклеарных фагоцитов и эндотелиальные клетки. Выявлена взаимосвязь между иммуномодулирующими и протективными свойствами коксиеллезных препаратов, установлено, что показатели раннего индуцированного ответа могут служить критериями эффективности последующей вакцинации коксиеллезной вакциной (Н.К. Токаревич).
Четвертым направлением исследований лаборатории является разработка препаратов для специфической профилактики и лечения зооантропонозных инфекций. Данное направление формировалось еще в блокадные годы, когда сотрудники лаборатории (К.Н. Токаревич, Е.М. Попова, А.Ф. Фомина) в короткие сроки освоили выпуск сыпнотифозной вакцины из легочной ткани инфицированных белых мышей; препарат был с успехом использован для иммунизации наиболее угрожаемых контингентов. Тогда же сотрудниками антирабического отдела (В.Г. Ушаков, С.А. Барановская) был разработан оригинальный метод пассирования вакцинного штамма вируса бешенства и производства антирабической вакцины, которую использовали для иммунизации военнослужащих и гражданского населения.
В послевоенные годы на базе лаборатории были продолжены исследования по технологии производства антирабической вакцины (T.И. Соловьев, И.А. Пискарева). Кроме того, в осажденном городе было проведено экспериментальное и клиническое изучение эффективности лептоспирозных сывороток реконвалесцентов и налажено их производство (К.Н. Токаревич, Е.М. Попова).
В 80-90-е годы совместно с сотрудниками НИИЭМ им. Гамалеи и Института военной медицины были проведены многоплановые исследования, направленные на разработку и испытания инактивированной комбинированной вакцины против лихорадки Ку.
В лаборатории были изучены биологические свойства различных штаммов коксиелл Бернета и отобраны из них наиболее перспективные для создания вакцин; разработаны количественные методы стандартизации коксиеллезных препаратов; определена роль отдельных субстанций коксиелл в индукции различных звеньев иммунной системы, а также проведен отбор адекватных критериев и методов для оценки эффективности вакцинных препаратов (Н.К. Токаревич).
Итогом этой работы (выполненной совместно с А.Б. Дайтером, И.В. Тарасевичем, А.Ж. Василенко и др.) явилось создание инактивированной комбинированной вакцины против лихорадки Ку, обладающей выраженными иммуногенными и протективными свойствами. Результаты морфологических исследований свидетельствовали о ее низкой реактогенности. При испытании на лабораторных животных и волонтерах показана высокая иммунногенная активность вакцины, однократное введение которой защищает животных от внутрибрюшного и аэрозольного заражения вирулентными штаммами коксиелл в течение всего периода наблюдения.
Государственные испытания этого препарата, проведенные в 2007 году, подтвердили ее низкую реактогенность и безопасность. По данным иммуноферментного анализа у 84% и 81% вакцинированных были обнаружены в сыворотке крови IgG антитела к коксиеллам Бернета 2-й фазы через один месяц и один год после однократного подкожного введения препарата, соответственно. Вакцина рекомендована для применения в практике. Новизна этого инновационного препарата подтверждена 9 авторскими свидетельствами и патентами на изобретения.
В настоящее время, в результате исследований, проводимых О.А. Фрейлихман, Ю.А. Панферовой, Н.А. Стояновой и Н.К. Токаревичем, получены новые данные, расширяющие представления о биологических свойствах и генетическом разнообразии популяции патогенных лептоспир и коксиелл, циркулирующих на территории России:
– установлено, что мультилокусный анализ тандемных повторов переменной копийности является высокодискриминативным методом генотипирования патогенных лептоспир;
– разработаны праймеры для генотипирования лептоспир методом MLVA к локусам VNTR_L1, VNTR_L2 и VNTR-Lb5;
– выявлено 22 генотипа лептоспир, различающихся по набору аллелей изученных локусов;
– по результатам анализа нуклеотидной последовательности 16S pPHK лептоспир выявлен ряд редко встречающихся генотипов, некоторые из которых являются уникальными;
– показана высокая дискриминационная способность VNTR-анализа C.burnetii и возможность применения этого метода для молекулярно-эпидемиологического анализа;
– секвенирование гена icmD C. burentii, позволило кластеризовать штаммы, выделенные от разных источников;
– сконструированы наборы праймеров и зондов для эффективного типирования штаммов C. burnetii в рамках полиморфизма A/G гена EnhA.1 и T/G гена TolQ.
Усовершенствована лабораторная диагностика лептоспироза, лихорадки Ку, иксодовых клещевых боррелиозов:
– с помощью методов генной инженерии сконструирована иммуноферментной тест-системы для диагностики лептоспироза (совместно с В.Н. Куликовым и А.А Козаренко)
– аргументирована возможность применения метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для идентификации штаммов лептоспир (совместно с Е.В. Зуевой);
– разработаны праймеры для создания диагностической тест-системы для определения количественного содержания лептоспир в биологическом материале методом ПЦР-РВ;
– разработана диагностическая тест-система для выявления C. burnetii в биологическом материале основанная на амплификации методом ПЦР-РВ по технологии TaqMan фрагмента гена groEL;
– оптимизирована ПЦР для выявления возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов;
– определена роль различных цитокинов в иммунопатогенезе лептоспирозной инфекции (совместно с О.А. Петровой и А.А. Тотоляном);
– установлено влияние климата на рост заболеваемости клещевого энцефалита на территории европейского севера России (Н.К. Токаревич совместно с А.А. Трониным, Б.А. Ревичем, Р.В. Бузиновым, В.П. Болтенковым).
Сотрудники лаборатории – участники двух международных проектов: «Роль мигрирующих птиц и питающихся на них клещей в распространении по Западно-Европейскому пути их перелетов важных для здравоохранения возбудителей инфекционных болезней» (осуществляется совместно с парижским институтом им. Пастера (Carniel) и болгарским институтом микробиологии им. Стефана Ангелова (Х. Найденский), а также проекта «Клещевые заболевания в регионе Баренцева моря, северной и западной Норвегии» (совместно с Норвежским институтом общественного здравоохранения). В результате проведенных исследований была показана роль мигрирующих птиц в качестве переносчиков и природных резервуаров C. burnetii и B. burgdorferi s.l, а также получены новые данные об активности природных очагов «клещевых инфекций» на территории СЗФО РФ.